推荐-神经阻滞重磅：神经内注射药物如何扩散
摘译：安妮，蒋鑫；点评：袁红斌海军军医大学附属长征医院近期的ANESTHESIOLOGY杂志刊登了一篇文章，介绍了外周神经阻滞时采用神经内注射技术，在显微镜下观察神经超微结构，观察药物的扩散。
研究背景
随着超声技术的引入和对神经显微解剖的进一步了解，“神经内注射可能造成伤害”这一传统观念遭到了质疑。尽管局部麻醉的先行者们曾建议进行神经内注射，但是，人们普遍认为药物的纵向扩散是造成严重破坏性神经并发症的主要原因之一，因为注射入神经内的物质可能到达脊髓甚至更深结构。自1948年来，“神经内注射有害”这一观点一直深植于局部麻醉理念中。针头设计和压力控制装置等整个行业的发展均围绕“避免神经内注射”这一观点。显微镜下可见，坐骨神经由胫神经和腓总神经构成，周围包绕神经周围膜（曾称为神经旁膜）（图1）。在腘窝坐骨神经分叉处，各神经由各自的神经外膜包裹，该结构固定存在且超声下可见。另一方面，肘部正中神经则是具有自身神经外膜和神经周围膜的单一神经。
图1. 坐骨神经示意图。有髓鞘或无髓鞘的轴突(Axon)包裹在神经内膜(Endoneurium)中。轴突和神经内膜被神经束膜(Perineurium)包裹，形成神经束(Fascicle)。多个神经束由神经外膜(Epineurium)包裹，形成神经——图中则为胫神经(T)和腓总神经(C)。这两个神经由神经周围膜(Circumneurium)（过去称神经旁膜Paraneurium）包裹，在接近腘窝处合并为坐骨神经。神经、动脉和肌肉共同处于肌外膜(Epimysium)的包裹中。以上每层结构均形成深层间隔(compartment)，包括：肌外膜下间隔(Sub-epimyseal)、神经周围膜下间隔(Sub-circumneural)、神经外膜下间隔(Sub-epineural)和神经束膜下间隔(Sub-perineural)。神经束膜下间隔又被称为束内腔(intrafascicular)，而神经外膜下间隔则为束间腔(interfascicular)。除束内腔外，各间隔均含有脂肪组织。神经内注射通常被定义为向单一神经（如胫神经、腓总神经或正中神经）行深达神经外膜的注射。目前，普遍观点认为神经内注射可造成束外扩散和束内扩散，后者与主要神经并发症相关。但是，局麻药神经内注射后的扩散范围仍不明确。神经阻滞定位技术（主要是非高清超声引导和神经刺激）并不能准确区分束内注射与束外注射，也不能确切区分神经外膜下注射与神经周围膜下注射。为进一步探索神经内注射药液的扩散与分布，本研究在超声引导下进行刻意神经内注射，模拟临床实践的情况，研究注射溶液在神经间隔的扩散。为此，本研究使用最近描述的标志物（【骨麻征途】神经阻滞必看——显微镜下识别和研究外周神经超微结构的新标志）——稀释的肝素化血溶液（HBS），该标志物不会离开所注入的间隙、不易引起组织形变，且在光镜及电镜下清晰可见。
方法
研究共使用8具新鲜尸体标本，使用标准22号D型针，在超声引导下对12条坐骨神经（经腘窝入路）及10条正中神经模拟临床神经阻滞，分别在腘窝水平和肘部对坐骨神经和正中神经注入20ml和5ml稀释肝素化血溶液（HBS）。超声可见神经肿胀证实神经内注射。将注射装置的给药速度设为1200ml/h，用BSmart TM注射压力监测仪测量注射压，将操作过程中的注射压保持在不超过15psi，以模拟常规临床操作。少数操作的注射压在15~20psi之间，但均未超过20psi。注射后30~45分钟取材，采集神经样本包括神经及全部周围组织（脂肪、肌肉、血管和筋膜），光镜及扫描电镜下观察。组织切片经石蜡处理后，用切片机制备厚度为3μm的连续切片，随后在常规条件下进行H&E染色，光镜下观察并拍照，放大倍数为×8~×800，扫描仪保存全尺寸横切面图。相同放大倍数下，用立体显微镜拍摄针头照片，使用Photoshop CC软件与组织横切面图片重叠。从第五具尸体标本获取坐骨神经样本，用于评估束内神经内膜特征，并在扫描电镜下观察可能存在的神经内空隙。用Photoshop软件对不同结构进行着色。研究主要任务包括识别标志物沉积的神经间隔、束外及束内间隔中标志物纵向扩散的距离、扩散HBS影响的神经束数量，并寻找其他可能存在的神经内扩散途径。次要目的包括观察是否存在任意神经结构（神经外膜、神经束膜、脂肪细胞、轴突）的破坏或形态改变。
结果
664个横切面标本中，除无脂肪细胞的束外间隔（图5），含有脂肪细胞的神经间隔内均观察到束外扩散（图2~4），而束内扩散仅见于2个神经标本的6个横切面。低倍镜下发现，这2个神经的一个神经束的神经内膜中心存在HBS“岛”（图2和图3）。神经束间及神经周围膜外可见束外神经外膜扩散的HBS混于神经束间的脂肪细胞中（图4）。注入的HBS细胞使脂肪细胞移位并在脂肪细胞间制造通路，但并不引起脂肪细胞的破坏或形变。所有标本的神经外膜、神经束膜和轴突也均未见破坏或形变。跨神经束膜扩散这一途径包括包裹神经束的神经束膜和在神经束间形成不完整间隔的神经束膜。与神经内膜相似，无任何脂肪细胞的神经外膜下间隔未见HBS细胞扩散。神经内膜中未观察到“神经周围”空隙，也未观察到任何束内扩散。
图2.正中神经的显微照片。A:完整的正中神经和经后期制作叠加在神经图像上的针的图像，以说明其相对最大的纤维束（F）的大小。HBS在纤维束神经内膜（En）下的空间内。B:和A一样的图像在更高倍率下显示束内明显的扩散，以及在神经束膜层之间扩散（P）。C和D:更高的倍率展示了神经束膜层之间的扩散。同时也展示了在神经束膜向内延伸形成的隔断之间的扩散（黄色部分）。
图3.坐骨神经的显微照片。A:完整的坐骨神经和经后期相同倍率放大的针远端叠加在神经束（F）上。胫神经（TN）的神经外膜（Ep）下间隙及神经周围膜（C;2）下间隙之间可见HBS（1）。腓总神经（CPN）束间的间隙未见HBS细胞。B:图像A的更高倍率图像,可见叠加图像上的针的远端开口横跨神经束。在神经束中央和神经内膜（En）内可见由HBS构成的“岛”（l）。C:HBS会在神经束和神经束膜层（P）之间的组织内扩散。D:HBS在神经束内沉积，经高倍率放大后，可见“伪神经束内”扩散。最深处的神经束膜层的隔断可见红细胞（3）。
图4.不同倍率下正中神经的神经内注射的显微照片。HBS的扩散受神经外膜（Ep）的限制。脂肪细胞（1）未被HBS破坏或变形。A:部分神经图像。标记物位于束外，不在束内。B:部分神经图像。可见标记物在脂肪细胞之间，未见改变的脂肪细胞。C:部分神经图像。标记物仅见于神经束外。D:部分神经图像。标记物仅接触到脂肪细胞，包裹神经束的胶原纤维以及神经内膜的内表面。
图5.正中神经的神经内注射的显微照片。神经内部的紧凑结构使得在神经束（F）之间、神经束膜内，或神经束内无法注射HBS。这是由于神经束之间缺乏脂肪细胞，这阻止了标记物在神经束间的扩散。在此例样本中，神经束间的组织由胶原纤维构成，无任何脂肪细胞。我们可以看到完整的、没有神经内HBS的正中神经。HBS完全包含在神经周围膜下空间（1），并且穿透了神经外膜（Ep）。这是一个真正的神经周围膜下注射，其在超声上显示类似于神经内（神经外膜下）注射。神经束间组织如（4）所示。A:神经周围膜（C）包括动脉（2），静脉（3）以及神经。HBS的扩散包绕这些结构而不穿透。这些是神经血管簇。B和C:神经束间（4）和神经束内组织（5，神经内膜（En）下）已以及神经束膜（P）一样，无任何HBS。D：外周神经的神经内膜的扫描电镜图像。其显示轴突（白色），髓鞘（浅绿色），以及神经内膜基质（淡紫色）。神经内膜及神经内膜和髓鞘之间（白色箭头）出现的通道和间隙实际是后期处理造成的。神经外膜、神经束膜和神经周围膜形成机械屏障，限制HBS向所注入的神经间隔外扩散。部分样本中可见神经间隔内外均存在HBS，这可能是由于注射针头开口跨越了两个间隔，而在超声引导注射时并未引起注意。部分样本可见HBS扩散至肌外膜下间隔，但不超过肌外膜。此外，神经束膜分子层间可见大量HBS细胞，充满整个神经束膜厚度（图6）。神经束膜似乎有所增厚，但作者并未测量其注射前后的厚度。
图6.不同倍率下HBS在胫神经束膜层扩散的显微图像。A：与神经束膜外侧接触的神经束间组织中的HBS。B：高倍率下的同一神经束（F）被神经束膜隔断（S）分隔。神经束膜层隔断内可见HBS红细胞。C：神经束膜及其隔断内可见充满HBS。束内红细胞“岛”代表了“伪束内”（或“伪神经内膜内”）扩散，因为其被神经束膜隔断最内侧面的细胞包裹。D：这张图像展示了束膜隔断将神经束分隔成几部分。这些隔膜填充满HBS。同一束的束膜隔断将轴突分开成若干组（E）。
部分神经束内未见HBS细胞（图2和图3），仅表现为单个坐骨神经（图3）或正中神经（图2）样本中心的HBS“岛”，仅累及神经的单个神经束。这些样本在低倍镜下被认为是束内注射，但是，高倍镜（×800）下观察相同横截面发现，红细胞是通过不完整间隔的神经束膜到达神经束中心（图6）。这种束内扩散可通过三个连续横切面识别：其中2个横切面中，红细胞“岛”的周围包绕完整的神经束膜（最内层），而在另一切面中（图6B）则为被破坏的神经束膜——可使扩散的红细胞与轴突直接接触。这些神经束的神经束膜完全被HBS细胞填充，包括形成隔膜处。明确神经束膜可作为传播途径后，作者进一步分析了神经束膜隔膜。横切面下2个或以上神经束分支处近端、或束膜联结附近的大部分神经束膜会凹陷入神经束，形成不完整隔膜。连续横切面可见，该隔膜长度逐渐延长直至形成另一个完整的神经束。这类隔膜在远端分为两个或以上神经束。存在明显束内扩散的两个样本的轴突未见移位、损伤或形变。红细胞未侵入轴突周围的神经内膜，也未分隔轴突。红细胞聚积成岛状，周围包绕轴突（图2和图3）。看起来在神经内膜内纵向扩散的HBS细胞，在两个方向上扩散距离均限于4mm以内。另一方面，坐骨神经和正中神经样本中，HBS细胞通过脂肪组织在神经束外向近端和远端的纵向扩散则分别不少于36mm和28mm。坐骨神经的束外扩散中，纵向扩散多于侧向或周围扩散。注入的20ml HBS并未全部填充坐骨神经，而是会聚集于神经外膜下或神经束膜旁的脂肪细胞周围。相反，注入正中神经的5ml HBS则全部填充于束外（神经外膜下）间隔。所有样本均未见轴突改变。将与横切面神经图放大倍数相似的进针图重叠后，作者发现，相关神经束往往比针头远端开口小。作者过去使用特殊染色证实，苏木精和伊红染色足以识别并区分神经内膜、神经束膜、神经外膜和神经周围膜。扫描电镜可见，大小不同的轴突形成神经内膜组织（是各轴突周围的混合胶原纤维紧密结构），Schwann细胞形成的髄鞘层占据轴突和胶原纤维神经内膜层之间的全部空隙。神经内膜内未见任何空隙（图5）。结论
刻意神经内注射HBS后，含有脂肪细胞的神经间隔均存在HBS的纵向扩散和束外周围扩散，而相对固态的神经内膜未见HBS扩散。既往对神经内注射的观点未曾考虑的是，即使刻意进行神经内注射也无法（或很难）将溶液准确注入神经束内，人们一直认为不小心将药液注入神经是很可能发生的情况。基于既往研究，作者以为会发现部分含有HBS的神经束，HBS可沿神经束进行双向纵向扩散（图7A），注入大量液体产生的束内压可造成神经束膜及神经外膜的破坏。Vlassakov等人最近对既往假说及麻醉医生对严重神经系统并发症的定义进行了总结，即神经束膜的破坏与直接束内注射后注入溶液向束外间隔的外渗。但是，令作者意外的是，本研究并未观察到支持该假说的证据。刻意进行神经内注射后大多数神经束未遭到破坏（图7B）。本研究结果不支持过去几十年坚持的观点和提出扩散途径。本研究发现存在神经束膜细胞层间而非神经内膜的扩散，又为后续研究提供了新思路。另一项意外发现是，神经束膜隔膜可作为纵向扩散的途径（图7B）。该途径可通过由相同神经束膜细胞层形成的神经束膜隔膜延伸至神经内膜，此途径以前未被描述。
图7.神经内扩散示意图。A：根据Vlassakov等人和既往对神经束内扩散的理解，预期扩散为束内扩散（1）、神经外膜下间隔的束外扩散（2），以及通过针孔反向渗漏的神经外扩散。B：本研究发现，神经束的神经内膜内无扩散，神经束膜胶原纤维之间、神经外膜深处神经束之间（1）、以及脂肪细胞之间（3）存在纵向和周围扩散，神经周围膜下间隔内无扩散阻力（未示出）。低倍镜下看来，形成隔膜的神经束膜细胞分子层间扩散似乎是“假性神经内扩散”。针头远端开口均大于神经束。在形成隔膜的神经束膜细胞内出现的岛状结构，低倍镜下看来似乎位于神经内或神经束的神经内膜内。
传统观点和研究结论基于四个假说：（1）因为动物模型可实现神经内膜内注射，所以人类神经束也可实现神经内注射；（2）神经外膜下或更深的注射（即通常定义的神经内注射）以及束内注射可造成神经组分破坏；（3）应避免神经周围膜下注射，例如腘窝处坐骨神经两分支之间，认为这也是可造成神经损伤的一种神经内注射；（4）如Moore等人关于将神经束与中枢神经系统直接相连的神经内膜内通道的阐述，“神经周围空隙是真实存在而非假象出来的”。然而，以上假说均未得到本研究的支持或证实。本研究发现，神经内结构紧凑且缺乏Moore描述的“真实而非想象”的神经内空隙，不可能直接对神经内组织注射液体，即束内扩散并无可能。此外，既往观点认为轴突是容易受损的复杂结构，将其想象为柔软、脆弱、似神经内膜胶原纤维一样易于充满液体的结构，也未得到本研究的支持。实际上，轴突和神经内膜似乎形成一种紧密且可抵抗注射溶液渗透的结构。作者还发现，对针头施加压力并不足以使注入溶液在神经束内产生纵向扩散，但足以造成部分反向渗漏、神经束外（神经外膜下间隔）的纵向及周围扩散、神经周围膜下间隔内扩散，以及跨神经束膜各分子层但不超过神经束膜最内层的扩散，包含脂肪细胞的间隔可见明显的标志物扩散。HBS在神经束间腔和神经束膜的脂肪组织内扩散几乎无阻力，但束外扩散仅发生于存在脂肪细胞的间隔。因此，通过内陷的神经束膜隔膜发生的神经束扩散应被视作“假性束内扩散”，并非直接的束内（神经内）注射。但是，至少理论上来说，神经束膜最内层的破坏可导致真正的束内扩散。检查全部横切面样本和远端针孔大小可明确，神经的各神经束比针孔小，使得注射溶液可在神经束膜层与束外组织间扩散。未来需使用与神经束大小相似或小于神经束的注射针进行类似研究。总之，如将神经内注射定义为深达神经外膜的注射，那么神经内注射很容易发生。但是，本研究进行刻意神经内注射后，并未发现通常意义上的束内注射。尽管研究样本量有限，作者认为似乎无法将HBS注入神经内膜。当然，作者并非提出基于本研究的发现可认为神经内注射是安全的。这种说法仍需大量有针对性的临床研究支持。
骨麻征途的点评
高分辨率的超声在临床应用越来越广，使得我们能识别大部分外周神经。某些粗大的神经，我们甚至能模糊的分辨更细微的结构。例如腘窝处的坐骨神经分叉，肌间沟或锁骨上入路的臂丛。更精细的分辨神经结构后，关于神经阻滞时注射的具体位置的争论由此而生。既往的观点认为将药物注射到神经外膜下是有害的，然而，近年来越来越多的研究开始故意的进行神经内注射，认为这样进行神经阻滞成功率高、起效迅速，并开始探讨注射的最佳剂量和浓度等。至于这样的操作是否会造成神经损伤，也是众说纷纭，各执一词。追本溯源，我们对于局麻药液在神经阻滞时的扩散方式还没有完全清楚。本期带来的这项研究，作者团队来自西班牙巴塞罗那几所大学，是神经内注射研究的著名团队，曾出版下面两本权威的参考书。
他们通过在冰鲜人类尸体的坐骨神经及正中神经内，刻意使用HBS进行神经内注射，显微镜下观察HBS在神经各超微结构间的扩散情况。本研究发现药液的扩散存在于神经束膜细胞层间而非神经内膜内的扩散。另外，神经束膜隔膜可作为纵向扩散的途径，该途径可通过由相同神经束膜细胞层形成的神经束膜隔膜延伸至神经内膜。
既往神经内注射的相关研究大多基于动物实验，然而，由于物种间神经结构的形态差异巨大，动物研究的结论恐怕不能完全照搬到临床工作中。如下图，为不同动物同样放大倍数下的坐骨神经横截面对比。神经及周围组织的结构和构成比例完全不同，很可能会导致药物的扩散方式不同。
不同动物同样放大倍数下的坐骨神经横截面
然而，我们同样要注意，人体不同部位神经的结构也存在差异，坐骨神经及正中神经的研究也可能不适用于其他的神经阻滞。并且，目前的超声对于神经结构层次的辨别以及注射的技术，还不能让我们可以“随心所欲”的将药液准确注入预计的部位。另外本研究采用的是HBS作为注射药物，与局麻药的扩散转运模式也不同。神经内注射的研究还在路上，最佳的神经阻滞注射部位和层次还没有定论，需要大家共同的参与。（摘译：安妮，蒋鑫；点评：袁红斌）
出处：古麻今醉网 https://mp.weixin.qq.com/s/VX82OoF8BQ-ijy4cLqYkKQ 其实在之前没有神经刺激仪的时代，我们用锐针进行神经阻滞麻醉，引出异感后行神经注射，很多都有可能是神经内注射，只是我们没有发现而已，过后也没有出现相关的神经并发症
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