叶酸代谢通路在全麻药物神经发育毒性中的作用机制

潍医小小麻

  美国食品和药物管理局（FDA）发布警告：妊娠末三个月的孕妇或3岁以下儿童在手术中重复或长时间（＞3小时）使用全麻药和镇静药，可能会影响胎儿及儿童的大脑发育。全麻药物和围术期应激对发育脑功能的影响及其远期效应排在麻醉学亟待解决的十大科学问题的第二位，是研究的重中之重1。婴儿期接受过麻醉及手术的患儿，后续成长中不伴有其他神经系统疾患和危险因素时，其脑白质髓鞘结构的完整性及体积的减少可能与早期麻醉和手术有关2。髓鞘主要由少突胶质细胞形成，全麻药物能够引起新生非人灵长类动物猕猴的少突胶质细胞的凋亡3-6，尤其是吸入麻醉药异氟烷还可以引起各年龄阶段的非人灵长类动物猕猴的少突胶质细胞的凋亡4-7。七氟烷已经取代异氟烷成为临床中最常用的吸入全麻药物，也是目前临床上婴幼儿患者最常用的吸入全身麻醉药物。Mark Baxter教授对新生猕猴使用临床浓度七氟烷进行多次麻醉来模拟临床因反复手术而接受多次麻醉的病人，发现多次麻醉后的猕猴一年后其出现了焦虑的增加，但是其机制未明8。

2019年5月3日，上海交通大学医学院附属第九人民医院麻醉科姜虹教授、上海神经所仇子龙研究员和哈佛医学院附属麻省总医院麻醉科谢仲淙教授在柳叶刀子刊《Ebiomedicine》上发表题为Disrupted folatemetabolism with anesthesia leads to myelination deficits mediated by epigeneticregulation of ERMN的研究成果。

在这项研究中，研究者们发现3岁以内的婴幼儿患者行七氟烷吸入全身麻醉后，其术后叶酸水平较术前均出现了下降。在七氟烷多次麻醉猕猴的动物模型中，其脑内叶酸代谢通路受到影响（建模过程中得到了Mark Baxter教授的悉心指导）。叶酸作为一碳单位供体以提供甲基基团的角色进而参与体内多种甲基化过程9。于是研究者们对猕猴前额叶皮质进行了全基因组甲基化测序，随后对转录组测序数据和全基因组甲基化测序进行了生物信息联合分析，发现七氟烷反复麻醉后的猕猴，其前额叶皮质中髓鞘发育关键基因ERMN的启动子区甲基化增高，其mRNA的表达下降。

髓鞘的发育和精细运动相关。梅奥儿童麻醉安全性（Mayo Aesthesia Safety inKids, MASK）这项涉及近一千病例的大样本回顾性分析发现多次接受全身麻醉和手术的患儿的精细运动能力下降10。

研究者们随后使用出生7天幼鼠（P7）每天使用3%临床浓度七氟烷处理2小时，连续3天来模拟临床幼儿经历复杂长时间手术或者需要多次手术时的全身麻醉，发现七氟烷也同样下调小鼠脑中叶酸代谢通路和ERMN的表达。重要的是，小鼠在P7天七氟烷处理后，于P14天和P30均发现了髓鞘产生减少，这意味着七氟烷对髓鞘发育的损伤是一个持续的过程。有研究发现在全身麻醉下接受多次麻醉和手术的婴幼儿患者，后续发育容易发生注意力缺陷综合征（ADHD）11-13。叶酸在婴幼儿期的缺乏同样也会引起其后续注意力缺陷综合征（ADHD）的发生14。小鼠腹腔注射叶酸可以回救七氟烷引起的髓鞘产生减少、TYMS和ERMN的表达下降以及学习和记忆能力损伤。研究者们通过不断地技术改进，使用微细针头（0.3ml, BD #328838, USA）准确的将携带ERMN的跨血脑屏障的AAV病毒注射到刚出生P0天的小鼠的心脏，该病毒通过血液循环并跨血脑屏障过表达ERMN于脑，发现其也可以回救七氟烷引起的髓鞘产生减少和学习和记忆能力损伤。

该结果提示吸入全麻药七氟烷影响了叶酸代谢通路，导致了发育期大脑甲基化紊乱，髓鞘相关重要基因ERMN的启动子区甲基化增高，表达量下降，髓鞘发育受损，引起了远期神经行为学异常。叶酸代谢通路可能是幼儿患者接受较长手术全身麻醉时及时检测或预防麻醉对大脑发育的重要靶点，叶酸可能是治疗全麻药物神经发育毒性的潜在药物。

全麻药物对灵长类动物和啮齿类动物神经发育毒性的表型并不完全一致，如七氟烷可以引起啮齿类动物明显的学习记忆损伤但在临床上很难观察到。七氟烷引起灵长类动物焦虑等行为也同样很难在啮齿类动物上观察到。因此，和早先研究不同的是，本文研究者是使用非人灵长类动物去探索全麻药物引起神经发育毒性的机制线索，然后找到非人灵长类动物和啮齿类动物具有相同变化的靶基因或目标，使用啮齿类模型来进行验证。该研究以临床患儿在七氟烷麻醉下接受手术时，其血清叶酸下降为切入点，结合七氟烷麻醉非人灵长类动物猕猴幼猴后其脑中叶酸依赖性酶TYMS的降低，提出了叶酸的降低会影响髓鞘发育关键基因ERMN启动子区的甲基化增高，进而影响了髓鞘发育以及远期神经行为学改变这一假设。 然后对经典的七氟烷多次麻醉幼鼠的模型进行腹腔注射叶酸和脑内过表达ERMN去逐一验证。因此，本研究的特色之处在于基础研究结合临床，且机制研究的动物模型包括啮齿类动物和非人灵长类动物，三者联合来阐明七氟烷对脑内甲基化的影响，有利于临床转化应用，具有一定的的临床意义和价值, 有望帮助明确临床常用吸入麻醉药毒性作用的潜在治疗靶点。

据悉，上海交通大学医学院附属第九人民医院麻醉科姜虹教授、上海神经所仇子龙研究员和哈佛医学院附属麻省总医院麻醉科谢仲淙教授为该论文的共同通讯作者，上海交通大学医学院附属第九人民医院麻醉科副主任医师、副研究员张磊为该论文的第一作者。博士生程燕咏和研究生薛镇宇实现了病毒在P0小鼠的心脏注射的技术突破。

全文链接：https://doi.org/10.1016/j.ebiom.2019.04.048

参考文献：

1.            曹君利；董海龙；方向明；王英伟；刘克玄；顾小萍；申乐；熊利泽. 麻醉学亟待解决的十大科学问题. 中华麻醉学杂志.2018;38:4-7.

2.            Block RI, MagnottaVA, Bayman EO, Choi JY, Thomas JJ, Kimble KK. Are Anesthesia and Surgery duringInfancy Associated with Decreased White Matter Integrity and Volume duringChildhood? Anesthesiology.2017;127:788-799.

3.            Paule MG, Li M,Allen RR, et al. Ketamine anesthesia during the first week of life can causelong-lasting cognitive deficits in rhesus monkeys. Neurotoxicol Teratol. 2011;33:220-230.

4.            Coleman K,Robertson ND, Dissen GA, et al. Isoflurane Anesthesia Has Long-termConsequences on Motor and Behavioral Development in Infant Rhesus Macaques. Anesthesiology. 2017;126:74-84.

5.            Brambrink AM, BackSA, Riddle A, et al. Isoflurane-induced apoptosis of oligodendrocytes in the neonatalprimate brain. Ann Neurol.2012;72:525-535.

6.            Creeley CE,Dikranian KT, Dissen GA, Back SA, Olney JW, Brambrink AM. Isoflurane-inducedapoptosis of neurons and oligodendrocytes in the fetal rhesus macaque brain. Anesthesiology. 2014;120:626-638.

7.            Schenning KJ,Noguchi KK, Martin LD, et al. Isoflurane exposure leads to apoptosis of neuronsand oligodendrocytes in 20- and 40-day old rhesus macaques. Neurotoxicol Teratol. 2017;60:63-68.

8.            Alvarado MC, MurphyKL, Baxter MG. Visual recognition memory is impaired in rhesus monkeysrepeatedly exposed to sevoflurane in infancy. British journal of anaesthesia. 2017;119:517-523.

9.            Crider KS, Yang TP,Berry RJ, Bailey LB. Folate and DNA methylation: a review of molecularmechanisms and the evidence for folate's role. Adv Nutr. 2012;3:21-38.

10.          Warner DO,Zaccariello MJ, Katusic SK, et al. Neuropsychological and Behavioral Outcomesafter Exposure of Young Children to Procedures Requiring General Anesthesia:The Mayo Anesthesia Safety in Kids (MASK) Study. Anesthesiology. 2018;129:89-105.

11.          Tait AR, Voepel-LewisT, Burke C, Doherty T. Anesthesia induction, emergence, and postoperativebehaviors in children with attention-deficit/hyperactivity disorders. Paediatr Anaesth. 2010;20:323-329.

12.          Sprung J, Flick RP,Katusic SK, et al. Attention-deficit/hyperactivity disorder after earlyexposure to procedures requiring general anesthesia. Mayo Clin Proc. 2012;87:120-129.

13.          Cartabuke RS, TobiasJD, Rice J, Tumin D. Hemodynamic profile and behavioral characteristics duringinduction of anesthesia in pediatric patients with attention deficithyperactivity disorder. Paediatr Anaesth.2017;27:417-424.

14.          Ghanizadeh A, SayyariZ, Mohammadi MR. Effect of methylphenidate and folic Acid on ADHD symptoms andquality of life and aggression: a randomized double blind placebo controlledclinical trial. Iran J Psychiatry.2013;8:108-112.