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严敏教授团队揭示锌指蛋白转录因子ZNF382在外周神经损伤后引起的神经病理性疼痛中的重要作用及其机制

板块介绍： #

浙江大学医学院麻醉手术部科研论坛主要致力于推送科室、医院以及领域内发表的高质量、高水平研究论文，以及经典、热门科研方法，欢迎业内同仁多与指教及投文。

作者：王烈菊

审校：郁丽娜

浙江大学医学院附属第二医院麻醉手术部严敏教授团队联合美国罗格斯大学新泽西州立医学院陶元祥教授团队、南加州大学洛杉矶分校Keck医学院Zilkha神经发生研究所以及南通大学疼痛医学研究所团队在免疫学顶级期刊《Journal of Experimental Medicine》作为封面论文发表了题为“ZNF382 controls mouse neuropathic pain via silencer-based epigenetic inhibition of Cxcl13 in DRG neurons”的研究论文，发现了在染色质构象环基础上，锌指蛋白转录因子ZNF382与靶基因功能元件—沉默子结合，同时招募多种表观调控蛋白共同发挥对神经病理性疼痛的调控作用。该论文的第一作者是浙大二院麻醉手术部马龙飞博士，共同第一作者是浙大二院麻醉手术部郁丽娜博士、南通大学姜保春研究员以及浙大二院骨科汪竞凯博士后，通讯作者为严敏教授，共同通讯作者是陶元祥教授。

研究背景

01

神经损伤引起的神经病理性疼痛是一种慢性难治性疾病，仅在美国每年就有超过600万人长期受神经病理性疼痛的折磨。周围神经损伤引起背根神经节（DRG）中初级感觉神经元内与疼痛相关基因在转录水平上发生表达改变，这些改变被证实与神经病理性疼痛的发展和维持相关，但对于其具体机制，我们知之甚少。本研究的目的是探讨周围神经损伤如何导致DRG中这些疼痛相关基因的表达改变，进而为神经病理性疼痛治疗提供新的理论依据。

研究方法

02

在实验技术方面，该研究应用一系列分子生物学实验手段结合高通量测序的方法，包括RNA原位杂交 (ISH) 结合免疫荧光三标染色技术、蛋白质免疫共沉淀 (CoIP)、DNA免疫共沉淀 (ChIP)、DNA免疫共沉淀测序 (ChIP-seq)、染色质构象捕获实验 (3C)、转录组芯片测序分析、分子克隆以及常规分子生物学实验方法。

在动物实验方面，选取了6-8周雄性和雌性小鼠，通过DRG显微注射技术以及转基因小鼠的应用，在体水平进行基因表达的干预以及应用CRISPR-Cas9等技术对基因组功能元件的操控。

在动物模型方面，该研究采用了3种外周神经损伤模型，包括小鼠腰4脊神经结扎模型 (SNL), 坐骨神经慢性缩窄模型 (CCI) 和坐骨神经分支损伤模型 (SNI)。

在动物行为学实验方面，该研究采用了小鼠机械缩足频率 (PWF）、机械缩足阈值 (PWT)和热缩足潜伏期（PWL）、条件偏好实验 (CPP)以及相关运动功能检测实验。

研究结果

03

研究首先发现与正常的DRG神经元相比，周围神经损伤后锌指蛋白ZNF382表达显著减少（图1）。在DRG选择性地过表达ZNF382可以显著缓解神经损伤引起的小鼠的神经病理性疼痛症状。通过微阵列分析发现，DRG中ZNF382过表达可以显著抑制细胞因子受体结合、趋化因子活动等信号通路，在一系列受抑制的致痛基因中，以趋化因子CXCL13表达抑制最为显著（图2）。CXCL13作为一个重要的致痛基因，在外周神经损伤后的DRG神经元中显著升高，并且可以引起明显的神经病理性疼痛症状。通过进一步的染色质免疫共沉淀测序（ChIP-seq）和染色质免疫共沉淀PCR（ChIP-PCR）实验发现，ZNF382与CXCL13基因启动子上游大约29555bp远处的intergenic片段结合，如果用decoy DNA阻断ZNF382与intergenic片段结合，或者用CRISPR-Cas9系统将该片段切除，可以破坏ZNF382对CXCL13的转录抑制作用，同时可以削弱ZNF382的镇痛效果。结合上述证据，这段243bp大小的intergenic片段很可能是DRG中CXCL13基因的沉默子元件。那么转录因子ZNF382与CXCL13的沉默子结合以后，是怎么样远距离调控CXCL13启动子活性的呢？进一步研究通过染色质构象捕获实验（3-C）证实，CXCL13沉默子片段与其启动子片段在空间上相互靠近，这提示了沉默子-启动子构象环的存在。另外，一系列的蛋白质免疫共沉淀（Co-IP）结果表明，ZNF382可以招募两种表观调控蛋白，分别是组蛋白去乙酰化酶HDAC1和组蛋白甲基化酶SETDB1，并且ZNF382/HDAC1/SETDB1复合物在外周神经损伤以后的DRG中形成明显减少。研究进一步发现HDAC1、SETDB1同时和CXCL13启动子区域的特定片段结合，介导CXCL13启动子区域的ac-H3和H3K9me3修饰（图3）。由于DRG中ZNF382表达降低，这引起ZNF382/HDAC1/SETDB1复合物形成减少，后者进一步导致了HDAC1/SETDB1在CXCL13启动子区域结合减少，相对应地，结合减少的HDAC1引起CXCL13启动子区域组蛋白乙酰化水平明显升高、结合减少的SETDB1引起CXCL13启动子区域组蛋白甲基化水平显著降低，组蛋白乙酰化水平升高和甲基化水平降低，两者的协同作用最终导致CXCL13启动子区转录活性增强，从而激活CXCL13的转录过程（图4）。

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图1  周围神经损伤后锌指蛋白ZNF382表达显著减少

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图2  DRG中ZNF382过表达可抑制趋化因子CXCL13

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图3 沉默子对于ZNF382表观遗传调控CXCL13是必要的

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图4 ZNF382参与调控神经病理性疼痛机制模式图

研究结论

04

该文从基因组功能元件、染色质空间构象和表观遗传学调控的角度阐述了锌指蛋白转录因子ZNF382在外周神经损伤后表达下调最终使CXCL13处于去抑制状态，由此引起的DRG神经元CXCL13表达上调最终介导了神经病理性疼痛的发生和维持，首次在疼痛领域探索了致痛基因的三维调控方式，为开发神经病理性疼痛药物提供了全新思路。

全文链接：https://doi.org/10.1084/jem.20210920

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马龙飞，浙江大学麻醉学科学学位博士生，导师严敏教授

本科毕业于徐州医科大学麻醉学专业，师从高灿教授，浙江大学医学院麻醉学直博生，师从严敏教授。多次前往美国交流学习，包括罗格斯大学新泽西州立医学院、杜克大学。主要研究方向为神经病理性疼痛的发病机制研究和治疗。目前以第一作者在Journal of Experimental Medicine、Frontiers in Pharmacology 发表高影响因子SCI论文2篇，在国际学术会议上汇报多次，作为主要参与者参与多项国家自然科学基金课题。

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